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Aug 08

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Analytik von DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen und Hybridisierung

1.1 Ethidiumbromid: (3,8 Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromid)

Beim Arbeiten mit Ethidiumbromid müssen Handschuhe getragen werden, da es sehr Cancerogen ist.

Ethidiumbromid ist ein organischer Fluoreszenzfarbstoff, der  sich aufgrund der planaren Struktur in die DNA einlagert. Der eingelagerte Farbstoff kann durch UV Licht (254-366nm) angeregt werden und emittiert Licht im orange-roten Bereich (390 nm).

1.2 Southern Transfer:

Da man das Agarosegel nicht weiterverarbeiten kann, wird ein Abklatsch des fragmentierten Plasmides auf eine Nylonmembran übertragen. Dabei wird eine Denaturierung der doppelsträngigen DNA mit NaOH durchgeführt.

1.3 Hybridisierung:

Hybridisierung ist die Anlagerung einer markierten Sonde an die komplementäre Sequenz auf der DNA. Bei einer Sonde kann es sich um

  • gereinigte RNA,
  • eine geklonte DNA-Sequenz oder
  • ein kurzes synthetisches Oligonucleotid handeln.

Anhand der Markierung lassen sich durch verschiedene Detektionsmethoden Anzahl und Größe der DNA-Fragmente nachweisen, die komplementär zur Sonde sind.

1.4 Markierung von Sonden:

Früher wurden die Sonden  radioaktiv markiert (meist mit 32P ), doch heute geschieht dies durch das Digoxigenin: Antidigoxigenin (DIG)- Indikatorsystem.

Das System basiert auf einer spezifischen Interaktion zwischen dem Steroid DIG und einem hochaffinen DIG- spezifischen Antikörper.

Quelle:

Referate Uni Bonn
Wikipedia

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