Transformation von Escherichia coli mit pUC19
Geschichte/Ursprung
Oswald Avery (21.Oktober 1877 – 2.Februar 1955) kanadischer Mediziner vor seinen Versuchen war unklar, welche Substanzklasse die Erbinformation trägt. SeinVersuch fand 1944 an Pneumokokken statt (Lungenentzündung). Das Ergebnis:
- zwei Arten von Stämmen (R-Stamm/S-Stamm)
- R-Zellen brauchen Informationen der S-Zellen um Schleimkapsel auszubilden
- R-Zellen wurden zu S-Zellen transformiert
Plastiden
sind kleine, i.d.R. ringförmige, autonom replizierende DNA Moleküle und gehören nicht zum Bakterienchromosom. Sie können mehrere Gene enthalten → Antibiotikaresitenz. Jedes Plasmid enthält mindestens eine Sequenz, die als Replikationsursprung dient (ORI) → Start
eine Klonierungsstelle („Polylinker“). Plasmide sind wichtige Werkzeuge der Molekularbiologie, Genetik, Biochemie. Sie werden dann als Vektoren bezeichnet und dazu benutzt, um Gene zu vervielfältigen oder zu exprimieren. Plasmide können verschiedene Konformationen besitzen:
- linear form
- open-circular form
- supercoil form
die Kenntnis der Form ist besonders wichtig für die Analytik, da die verschiedenen Formen verschieden schnell und verschieden weit laufen bei der Gelelektrophorese .
pUC 19, künstlich hergestellte, bakterielle Plasmide
- pUC 18 und pUC19 sind künstlich hergestellte, bakterielle Plasmide
- am häufigsten verwendete Vektoren zur Klonierung und Expression von Proteinen in E.coli
- spezieller Vorteil: hohe Anzahl von Kopien pro Bakterienzelle (high copy number-Plasmide) → große Menge Plasmid kann isoliert werden
- relativ klein → 2686 bp (Basenpaare)
- an spezifischen Schnittstellen können zusätzliche DNA Fragmente eingefügt werden
- die Transkription von eingefügten Genen in E. coli kann durch Induktion des eingebauten lac-operons gezielt eingeleitet werden
- zur Selektion von pUC-positiven Bakterien nach Einfügung des Plasmids in einen geeigneten Bakterienstamm (Transformation) dient ein in den pUC-Plasmiden vorhandenes Ampicillin-Resistenzgen (ampR).
- Unterschied der beiden Plasmide in der inversen Orientierung der multiple cloning sites (MCS)
DNA Übertragung
- Transformation: nicht-virale Aufnahme von freier DNA in kompetente Bakterienzellen
- Transduktion: Gentransfer zwischen Bakterien durch Viren. Gene werden übertragen, ohne dass Bakterien Kontakt miteinander haben
- Konjugation: Übertragung von Teilen des Genoms von einer Spender- auf eine Empfängerzelle
Kompetenz wird in Anzahl Kolonien pro μg DNA angegeben, natürliche Kompetenz besitzen z.B :
- Haemophilus influenza
- Helicobacter pylori
- Bazillus subtilis
künstliche Erzeugung der Kompetenz
- Calciumchlorid Methode (klassische Methode)
- Electroporation
Calciumchlorid Methode
Hitzeschock → 90s bei 42° C danach 45s auf Eis
- Bakterien werden 24h in einer eiskalten CaCl2-Lösung inkubiert → Permeabilität der Zellwand ändert sich, DNA kann in Zellen gelangen
- DNA Gabe und Erhöhung der Temperatur → DNA wird nun erleichtert in die Zellen aufgenommen
Elektroporation durch Entladung eines hochaufgeladenen Kondensators durch die Zelle wird DNA in die Zelle gezogen. Membran wird kurzzeitig für DNA durchlässig gemacht.
Gelekelkrophorese
- Prinzip:Eine Mischung aus zu trennenden Molekülen wandert unter Einfluss eines elektrischen Feldes durch ein Gel, welches in einer ionischen Pufferlösung liegt. Je nach Größe und Ladung der Moleküle bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das als Molekularsieb wirkende Gel. Dabei wandern kleine, negativ geladene Moleküle am schnellsten in Richtung der positiv geladenen Anode und positiv geladene Moleküle in Richtung der negativ geladenen Kathode.
Uni Referat automatisch zur Verfügung gestellt. Farmatix Bonn
Quellen:
Praktikumsskript SS 2011
www.wikipedia.de
Theodor Dingermann, Gentechnik – Biotechnik. – Stuttgart. Wiss. Verl.-Ges., 1999
von der Leyen – Wendt – Dieterich (Hrsg.), Gentherapie und Biotechnologie. Ansätze zu neuen Therapieformen in der Medizien. – Stuttgart. Wiss. Verl.-Ges., 1999
Pharmazeutische Biologie 1. Grundlagen und Systematik Wissenschaftliche Verlagsges.; Auflage 7